不同胎龄小鼠胎肝干细胞的性状比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.23.014

摘要/Abstract

摘要：

背景：胎肝干细胞具有比骨髓干细胞更强的增殖分化能力和更低的免疫原性和免疫活性，逐渐受到关注，目前多数研究集中在成体肝干细胞，对小鼠胚胎肝干细胞的研究较少。
目的：比较不同胎龄小鼠胎肝干细胞的生物学性状，探讨胎肝发育过程中干细胞的变化。
方法：采用机械分离结合酶消化法及差速贴壁法分离培养不同胎龄(13.5 d，16.5 d，19.5 d)的小鼠胎肝干细胞，对原代细胞形态，生长状态及表面标记物进行观察比较。
结果与结论：胎龄13.5 d组胎肝干细胞形态均一，生长状态良好，干细胞特性明显，白蛋白和细胞角蛋白19基本无表达，提示胎肝干细胞处于相对原始的未分化阶段。随胎龄增加，胎龄16.5 d，19.5 d组胎肝干细胞形态差异渐大，生长状态渐次，白蛋白和细胞角蛋白19阳性表达率增加。提示胎肝干细胞逐渐向具有肝细胞和胆管细胞标志的双显型干细胞方向转化。

关键词: 干细胞, 干细胞培养与分化, 昆明小鼠, 胎龄, 胎肝干细胞, 形态学, 细胞表面标志物, AFP, c-kit, ALB, CK19, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Increasing attention has been paid on embryonic hepatic stem cells that have stronger proliferation and differentiation capacities, as well as lower immunogenicity and immunological activity than bone marrow stem cells. The majority of related studies focus on adult hepatic stem cells, and little evidence addresses mouse embryonic hepatic stem cells.
OBJECTIVE: To compare the biological characteristics of mouse embryonic hepatic stem cells at different gestational ages and to explore the changes of stem cells during embryonic hepatic development process.
METHODS: The mouse embryonic hepatic stem cells at different gestational ages (13.5, 16.5 and 19.5 days) were isolated and cultured with mechanical separation, enzyme digestion and differential adherence methods. The primary cell morphology, growth and phenotypic markers were observed and compared.
RESULTS AND CONCLUSION: The embryonic hepatic stem cells at gestational 13.5 days showed uniform morphology, good growth, and apparent characteristics of stem cells, the albumin and cytokeratin 19 were not expressed. This is evidence that embryonic hepatic stem cells are under primary un-differentiated stage. As the increase of gestational age, embryonic hepatic stem cells presented morphological changes and poor growth, the albumin and cytokeratin 19 expression was increased. Experimental findings indicate that, embryonic hepatic stem cells may differentiate into double dominant stem cells with both hepatic cells and biliary tract markers.

Key words: stem cells, stem cell culture and differentiation, Kunming mice, gestational age, embryonic hepatic stem cells, morphology, cell surface marker, alpha-fetoprotein, c-kit, albumin, cytokeratin 19, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

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图/表（结果） 5

2.1 获取的原代及传代昆明小鼠胎肝干细胞的形态 接种后6 h左右，原代细胞逐渐贴壁。大部分细胞在接种后24 h左右贴壁完成。48 h后可见较多细胞集落形成，大小不等。集落细胞形态大部分为卵圆形或圆形, 细胞核大, 核质比例高。接种后72 h，各组贴壁细胞中均有部分细胞发生形态变化：胞质突出，细胞形态呈现为梭形。随换液次数的增多，培养时间的延长，悬浮细胞被逐渐清除。接种后第5天，悬浮细胞基本被清除完全，培养瓶/板内仅可见贴壁细胞。部分细胞集落开始松散分离，并与相邻细胞贴近融合，见图1A。
进行细胞传代培养后6 h，可观察到传代细胞尚未完全贴壁，3组细胞形态学差异较大。胎龄13.5 d组细胞的形态大小基本均匀相同，见图1B；胎龄16.5 d组细胞形态大小差别较为明显，见图1C；胎龄19.5 d组细胞大小差别更大，部分细胞直径可相差二三倍，见图1D。

2.2 胎龄13.5，16.5，19.5 d昆明小鼠胎肝干细胞集落数量及生长状况 原代接种后的第5天，每组分别随机选取培养瓶/板9个，置于低倍光学显微镜(×100)下。每瓶/板随机分别选择不重合的视野3个，对视野内细胞集落数量计数。计算其代数平均值，用对应的小鼠胎肝质量校正(集落数量/胎肝质量)，结果见表1及图2。

3组细胞生长状况比较：胎龄13.5 d组细胞生长状况最佳：集落贴壁牢固，出现贴壁不牢导致死亡而漂浮的细胞比例最低，半数以上细胞集落能生长至传代。胎龄16.5 d组细胞生长状况稍差：1/3左右的贴壁细胞集落能生长至传代；2/3左右细胞贴壁不稳或死亡悬浮，被换液除去。上述两组中的贴壁细胞，随着培养时间的增加，呈现为形态较均一的长梭形，见图3A。而后逐渐铺展生长成上皮细胞状，呈无序或旋涡状排列，见图3B。胎龄19.5 d组细胞生长状况最差：原代接种后第5天，贴壁细胞集落明显少于上述两组，绝大部分细胞集落在接种后数天内死亡，被换液除去。残余的极少部分贴壁细胞增殖力极差，基本无法传代。

2.3 胎龄13.5 d，16.5 d，19.5 d昆明小鼠胎肝干细胞表面标志物鉴定结果 细胞呈棕黄色为阳性，无颜色则为阴性。3组集落细胞的甲胎蛋白，人干细胞因子受体几乎均表达为阳性，3组间上述两项生化指标阳性率差异无显著性意义(P > 0.05)。
胎龄13.5 d组集落细胞几乎不表达白蛋白和细胞角蛋白19。胎龄16.5 d组大半数集落细胞白蛋白和细胞角蛋白19呈阳性表达。胎龄19.5 d组白蛋白和细胞角蛋白19呈阳性表达的细胞比例更高。白蛋白的表达情况，胎龄13.5 d组与胎龄16.5 d，19.5 d组之间差异有显著性意义(P < 0.05)，而胎龄16.5 d组与胎龄19.5 d组之间差异无显著性意义(P > 0.05)。细胞角蛋白19的表达则是两两组间差异均有显著性意义(P < 0.05)。结果见表2，图4，5。

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引言

材料方法

设计：体外细胞学对比观察实验。
时间及地点：实验于2009年1至5月在重庆医科大学细胞实验室完成。
材料：
实验动物：昆明小鼠由重庆医科大学实验动物中心提供，饲养于清洁级动物房中，自由饮水及进食。雌雄小鼠分笼饲养，雌雄以2∶1 比例合笼过夜。次日清晨检查，以雌鼠出现阴栓为受孕，以发现阴栓当日上午计为孕龄0.5 d。选取孕龄分别为13.5 d，16.5 d，19.5 d的孕鼠各5只。
各胎龄期小鼠胎肝干细胞性状研究所用的主要试剂和仪器：
Main experimental reagents and instruments:

实验方法：
胎肝干细胞的获取和培养及传代：参见作者的前期实验报道^[7] 。采用机械分离结合酶消化法及差速贴壁法获取胎肝干细胞。0.2%明胶铺被培养瓶/板，二氧化碳孵箱内放置24 h后吸出，晾干备用。孕鼠处死后取出胚胎，解剖显微镜下分离胚胎肝脏，天平称质量；PBS洗涤，剪碎为1 mm³组织块；离心管内加入0.1%的Ⅱ型胶原酶溶液/EDTA于37 ℃水浴中振荡消化15 min，上层液体100目滤器过滤，下层组织重复上述消化过程两三次；等量D-Hank’s溶液终止消化；1 000 r/min离心8 min。弃上清液，沉淀中加L-DMEM培养液(含体积分数为15%胎牛血清)；吹打成细胞悬液。置培养瓶/板中，37 ℃、饱和湿度、体积分数为5% CO₂孵箱孵育1.5 h，取细胞悬液，再次贴壁1.5 h。细胞浓度调整至2×10⁸ L^-1，种植于培养瓶/板。
按胎龄13.5 d(ED13.5)，16.5 d(ED16.5)，19.5 d (ED19.5)，将不同孕鼠个体分离出的胎肝细胞置于不同培养瓶中，每组15瓶。置上述环境培养，3 d后换培养液，此后每24 h换液1次。
细胞集落生物学特性的鉴定：原代接种后5 d，每组随机选取9个培养瓶/板，每个培养瓶/板中随机选择3个贴壁细胞集落进行细胞爬片。采用SABC法进行细胞表面标志物检测。标记方法参照SABC试剂盒说明书进行操作。标记物有人干细胞因子受体(c-kit)、甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、细胞角蛋白19(CK19)。每瓶/板所选的3个细胞集落，其指标阳性率的代数平均值，作为该瓶/板的细胞集落的指标阳性率。
主要观察指标：光学显微镜下观察细胞生长及增殖情况；SABC法进行细胞表面标志物检测，观察不同胎龄组细胞表面标志物阳性率。
统计学分析：用SPSS 12.0软件处理数据。数据进行正态性检验，正态分布的数据以x(_)±s表示。两两组间比较采用t 检验；计量资料多组间比较采用完全随机单因素F检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

实验对胎肝发育过程中胎肝干细胞变化规律进行了探讨，主要从细胞的增殖能力和生物学性状方面进行研究，目的是筛选出更多数量具有良好增殖能力和相对原始未分化的胎肝干细胞，为后续的研究提供依据。
胎肝干细胞的增殖能力可以通过贴壁细胞集落的数量来反映。单独就形成的胎肝干细胞集落总体数量而言，16.5 d胎龄组的胎肝最多。但前提是其分离胎肝干细胞的胎肝总质量远超过13.5 d组。用对应的胎肝质量校正后，可以看出：单位质量胎肝中含有的具有形成集落能力的胎肝干细胞，13.5 d组明显多于16.5 d组，更远多于19.5 d的胎肝。
由于目前尚未无明确统一的肝干细胞的特异性标志物，作者参考相关文献，选用的标志物为：人干细胞因子受体，甲胎蛋白，白蛋白，细胞角蛋白19。其中人干细胞因子受体是干细胞的标记物。而甲胎蛋白既可在卵圆细胞表达，也在胎肝细胞中表达，但不在成熟肝细胞和胆管细胞表达。白蛋白是肝细胞的标志物；细胞角蛋白19是胆管细胞的标志物，在成熟的肝细胞和胆管细胞中表达，也可在原始的未成熟肝系细胞表达^[20-25] 。
实验分离的细胞，呈集落样生长，核质比例高，表达人干细胞因子受体，表明具有干细胞的特性。甲
胎蛋白为阳性表达提示胎肝细胞的特性。胎龄不同，其胎肝干细胞性状也有差别。13.5 d组胎肝分离的干细胞：生长状况良好，大小形态均一，白蛋白和细胞角蛋白19基本无表达，提示胎肝干细胞处于相对原始的未分化阶段。16.5 d组胎肝干细胞：生长状况稍差，大小形态差异较大，白蛋白和细胞角蛋白19阳性表达率增加，提示胎肝干细胞逐渐向同时具备肝细胞和胆管细胞标志物的双显型干细胞方向转化。19.5 d组胎肝干细胞：生长状况更差，基本无增殖能力；大小形态差异大，细胞标志物提示该类细胞已非常接近成熟的肝细胞和胆管细胞。文章报道结果证实了部分相关文献报道^[18,26-27] 。
目前学者们对肝干细胞向肝细胞及胆管细胞分化的具体模式尚无明确结论。目前倾向于两种模式：其一：肝干细胞在发育成熟时，细胞角质蛋白及白蛋白基因同时激活，形成表达白蛋白和细胞角蛋白19的双显型细胞。在其后的分化过程中，再失去白蛋白向胆管细胞方向分化；或者失去细胞角蛋白19向肝细胞方向发育。其二：在其子代的两个细胞中，向胆管细胞或者肝细胞方向分化，肝细胞的分化先于胆管细胞。实验仅仅选取了3个胎龄点，相对片面，也未能解决该问题，尚需进一步探索。